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La mwcqmwcgRNA interference (dall'inglese mwcwinterferenza dell'RNA, abbreviata comunemente come mwdaRNAi) è un meccanismo mediante il quale alcuni frammenti di mwdqRNA sono in grado di interferire (e mwdgspegnere) l'mwdwespressione genica.

La RNAi si distingue da altri fenomeni di silenziamento genetico, dal momento che in mweqmwegCaenorhabditis elegans è stata osservata essere in grado di diffondere da cellula a cellula e di essere ereditabile. Ciò è stato osservato anche nelle mwewpiante, oltre che nei mwfamammiferi ma, nell'ultimo caso con minore efficienza, e solo nei primi stadi dello mwfqsviluppo embrionale. Si distingue quindi tra meccanismi coinvolgenti molecole a doppio filamento, RNA interference in senso stretto, mediate da molecole come mwfgShort interfering RNA e fenomeni coinvolgenti mwfwmiRNA, a singolo filamento.

• Storia

• Il processo molecolare

• Funzione e significato evolutivo

• La scoperta

• Silenziamento genico

• Applicazioni in medicina

• Note

• Altri progetti

• Collegamenti esterni

Prima che la RNAi fosse ben caratterizzata, i diversi fenomeni di silenziamento genico legati all'RNA erano indicati con vari nomi, come mwgwsilenziamento genico post-trascrizionale, mwhasilenziamento genico indotto da virus, mwhqco-soppressione dell'espressione genica o mwhgsilenziamento transgenico. In seguito alla caratterizzazione completa del processo, è stato chiaro che questi due fenomeni fossero in realtà espressione dello stesso meccanismo.

L'uso dell'RNA per ridurre l'espressione genica nelle piante è stata una procedura comunemente usata per molti anni. RNA antisenso a singolo filamento venivano introdotti nelle cellule vegetali che si appaiavano con l'RNA messaggero a singolo filamento ad esso complementare. Mentre gli scienziati credevano inizialmente che il doppio filamento di RNA risultante dall'appaiamento non potesse venir tradotto in una proteina, è ora chiaro che l'RNA a doppio filamento avvia invece il meccanismo dell'interferenza. L'uso di RNA a doppio filamento è diventato più diffuso dopo la scoperta del meccanismo molecolare dell'RNAi, inizialmente in mwiapetunia, più tardi in mwiqCaenorhabditis elegans. Nel 1990 Jorgensen la scopre, introducendo transgeni responsabili della pigmentazione della petunia per ottenere petunie più scure, viola intenso. Accade però che la pigmentazione è inspiegabilmente ridotta del 40% nelle petunie transgeniche che diventarono addirittura più chiare; e una ridotta espressione del gene endogeno oltre che del transgene (cosoppressione)

La RNAi è un processo specifico e potente portato avanti dalla cellula. Sebbene non tutti i dettagli del processo stesso siano ancora chiari, sembra che il cosiddetto mwkamacchinario dell'RNAi, una volta individuata una molecola di RNA a doppio filamento (dsRNA), sia in grado di avviare il meccanismo della RNAi.

1. Attraverso un enzima (chiamato mwkwmwlaDicer), la sequenza di dsRNA è tagliata in frammenti di lunghezza minore (19-21 paia di basi).

2. Il breve frammento di dsRNA (chiamato mwlgshort interfering RNA, o mwlwsiRNA) si associa ad un complesso enzimatico denominato RISC (dall'inglese mwmaRNA induced silencing complex, mwmqcomplesso silenziatore indotto dal Rna).

3. L'RNA a doppio filamento viene mwmwaperto, probabilmente da una mwnaelicasi: solo il filamento di RNA antisenso rimane associato a RISC, mentre il filamento mwnqsenso viene degradato.

4. La RISC è ora attiva: è in grado di scansionare molti mwnwmRNA presenti nel mwoacitosol fino a trovarne uno mwoqcomplementare al frammento di RNA antisenso associato al complesso stesso.

5. Se l'appaiamento tra siRNA e mRNA è perfetto (o quasi perfetto), una componente della RISC (detta mwowargonaute protein o mwpaArgo) è in grado di operare un taglio sull'mRNA. I due frammenti di mRNA risultanti, privo di cappuccio al 5' uno e di coda di poliA al 3' l'altro, vengono così rapidamente degradati dalle mwpqRNAsi della cellula stessa. Se l'appaiamento, invece, non è perfetto, si pensa che la RISC sia comunque in grado di inibire la mwpgtraduzione del mwpwgene. Sebbene il meccanismo di questo secondo evento non sia chiaro, sembra che possa essere molto diffuso negli animali.

Il meccanismo della RNAi è ampiamente utilizzato nel silenziamento dell'mwrwespressione genica: è stato osservato che certe regioni genomiche codificano per alcune brevi molecole di RNA (dette genericamente mwsamicroRNA), in grado di ripiegarsi a formare una forcina (si parla in questo caso di mwsqshort hairpin RNA, o mwsgshRNA). Quando gli enzimi della RNAi individuano tali molecole, le processano come precedentemente detto, quindi sono in grado di portare alla degradazione tutti gli mwswmRNA mwtacomplementari presenti nel mwtqcitosol. La riduzione della presenza degli mRNA ha come ovvia conseguenza il calo di sintesi della proteina da essi codificata. Questo meccanismo è stato inizialmente individuato come mwtgJAW microRNA in mwtwmwuaArabidopsis thaliana: questo RNA è coinvolto nella regolazione di alcuni geni che controllano la forma della pianta. In seguito, sono stati individuati numerosi altri microRNA dal meccanismo simile in numerosi organismi mwuqeucarioti (più di 300).

Un altro possibile significato della RNAi può essere legato al fatto che il ciclo vitale e replicativo di molti mwuwvirus comprende un passaggio durante il quale il mwvagenoma virale è costituito di dsRNA. Ciò induce a pensare che il sistema della RNAi si sia evoluto anche per rispondere alle infezioni virali.

La RNAi è stata anche legata a numerosi processi cellulari, come la formazione della struttura del mwvgcentromerocite-ref-1[1] e della mwwweterocromatinacite-ref-2[2].

La rivoluzionaria scoperta della RNAi avvenne per caso in seguito ad esperimenti in corso su organismi vegetali negli mwzwUSA e nei mwaaPaesi Bassi a cavallo tra gli mwaqanni ottanta e gli mwaganni novantacite-ref-3[3]. In particolare, i ricercatori stavano lavorando sulla produzione di fiori di mwbwPetunia con colorazione più vivace. Per raggiungere questo scopo, introdussero nelle piantine alcune copie aggiuntive di un mwcagene noto per codificare un mwcqenzima chiave nella colorazione dei mwcgpetali. Sorprendentemente, molte piantine così trattate non presentavano gli attesi colori intensi ma erano privi di colore. Attraverso un'analisi più precisa, i ricercatori furono in grado di scoprire che sia il gene endogeno che il mwcwtransgene erano stati mwdasoppressi. Per questo motivo, il fenomeno fu inizialmente definito come mwdqco-soppressione dell'espressione genica: il meccanismo molecolare, in ogni caso, rimaneva ignoto.

Alcuni anni più tardi, alcuni mwdwvirologi vegetali fecero un'osservazione simile. Le loro ricerche erano indirizzate all'individuazione dei meccanismi di resistenza delle piante contro i mweavirus. In quel periodo si era dimostrato che le piante erano in grado di produrre mweqproteine specifiche virali. Queste proteine erano in grado di rendere le piante mwegtolleranti o mwewresistenti alle infezioni virali. In ogni caso, essi osservarono che, sorprendentemente, anche le piante aventi solo brevi frammenti degli RNA codificanti per quelle proteine erano in grado di resistere alle infezioni virali. Essi conclusero che tali molecole di RNA fossero in grado di mwfaattaccare i virus, inibendone la replicazione e la diffusione attraverso la pianta. Agendo in senso inverso, provarono in seguito ad introdurre brevi sequenze geniche all'interno dei virus che infettano piante. Allo stesso modo, in seguito all'infezione con questi virus, le piante non erano più in grado di produrre proteine dai quegli specifici geni. I ricercatori chiamarono questo fenomeno mwfqsilenziamento genico indotto da virus (o mwfgVIGS, dall'inglese mwfwvirus-induced gene silencing). I fenomeni individuati fino a questo punto furono denominati mwgasilenziamento genico post-trascrizionalecite-ref-4[4].

In seguito a queste osservazioni iniziali, molti laboratori iniziarono a ricercare il processo molecolare alla base di queste manifestazioni. Nel 1998 gli statunitensi mwhgAndrew Fire e mwhwCraig Mello iniettarono RNAds all'interno di mwiaCaenorhabditis elegans, un mwiqverme nematode, individuando un potente effetto di silenziamento. Il termine mwigRNA interference fu coniato in questa occasionecite-ref-5[5].

Nel mwka2006 Fire e Mello hanno vinto il mwkqPremio Nobel per la medicina e fisiologia per i loro lavori nel campo della RNA interference.

La RNAi sta avendo un numero crescente di applicazioni nel campo dell'mwlaingegneria genetica. In particolare, la RNAi viene utilizzata per silenziare selettivamente l'mwlqespressione genica al limite di qualunque gene. Questi studi, chiamati di mwlgmwlwloss of function, permettono di identificare il ruolo di un determinato gene attraverso il suo mwmaspegnimento. Il meccanismo della RNAi, da questo punto di vista, risulta molto ben adattabile a questo tipo di finalità. La RNAi, oltretutto, permette di svolgere studi di mwmqloss of function senza eliminare fisicamente un gene (un processo definito mwmgmwmwknock-out): lo mwnaspegnimento mediato da RNAi, infatti, è genericamente definito mwnqmwngknock-down. I vantaggi di questa modalità consistono tra l'altro nella possibilità di ripristinare l'attività del gene silenziato (attraverso l'utilizzo di sistemi di transgenesi condizionale)cite-ref-6[6].

La maggior parte delle applicazioni della RNAi sono state portate avanti su mwpaorganismi modello come mwpqmwpgCaenorhabditis elegans ed il moscerino della frutta mwpwmwqaDrosophila melanogastercite-ref-7[7]cite-ref-8[8]. mwsqC. elegans è particolarmente utile negli studi su e con RNAi, dal momento che gli effetti del silenziamento genico su questo organismo sono generalmente ereditabili e perché l'inserimento dall'esterno di RNAds è particolarmente semplice. Attraverso un meccanismo i cui dettagli non sono ancora ben noti, infatti, è possibile servirsi di batteri come mwsgmwswEscherichia coli per trasferire RNA nell'organismo. mwtaC.elegans viene nutrito con questi batteri, che così trasferiscono RNA al verme direttamente nel tratto intestinale dell'animale. Questo processo è molto efficiente e veloce, nonché molto meno oneroso dei metodi tradizionali, come l'inserimento dell'animale in una soluzione contenente l'RNA da trasferire o l'iniezione dello stesso RNA nelle mwtqgonadi dell'animalecite-ref-9[9].

Il dsRNA che avvia la RNAi può essere utilizzato come mwvafarmaco. La prima applicazione in questo senso a raggiungere i mwvqtrial clinici è stata quella per il trattamento per la mwvgdegenerazione maculare. La RNAi è anche stata dimostrata essere molto efficace nella reversione del danno epatico in modelli animali mwvwmurini. Un altro utilizzo possibile di questi farmaci potrebbe essere quello di repressori di geni essenziali di numerosi patogeni (batterici o virali). In questo modo, come avviene del resto già per la maggior parte dei farmaci in commercio, il patogeno non sarebbe in grado di sopravvivere. La RNAi, ad esempio, si è dimostrata efficace nel silenziamento dei geni di mwwaHIV in un modello della malattia in topo.

Dal momento che la RNAi mwwginterferisce solo con molecole di mwwwacido nucleico già trascritte (e non direttamente con il mwxaDNA), essa potrebbe avere un interessante sviluppo nel campo della mwxqterapia genica. I sostenitori delle terapie a base di RNAi, infatti, ricordano che queste non solleverebbero tutti i dubbi etici che attualmente un qualsiasi intervento sul DNA sembra comportare: i mwxgfarmaci ad RNA, infatti, sarebbero considerati dall'opinione pubblica alla stregua dei farmaci attualmente in uso. Per questo motivo, la RNAi e le terapie basate sulla RNAi stanno attraendo un numero sempre maggiore di industrie farmaceutiche e biotecnologiche.

cite-note-11. ↑ mwzq(mwzgmwzwENmw0a) mw0qVolpe TA mw0get al - mw0wRegulation of heterochromatic silencing and histone H3 lysine-9 methylation by RNAi - Science. 2002 Sep 13;297(5588):1818-9

cite-note-22. ↑ mw1w(mw2amw2qENmw2g) mw2wSchramke V mw3aet al - mw3qHairpin RNAs and retrotransposon LTRs effect RNAi and chromatin-based gene silencing - Science. 2003 Aug 22;301(5636):1060-1

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Altri progetti

• Wikimedia Commons

• Wikimedia Commons contiene immagini o altri file su RNA interference

• mwatu(EN) mwatyAnimazione del processo della RNAi, dal sito della rivista mwatcNature

• mwatk(EN) mwatomwatsPlanting the Seeds of a New Paradigm, review su PLos (Public Library of Science) riguardante la RNAi

• mwat0(EN) mwat4mwat8RNAi:The Long and Short of It, una presentazione della RNAi, con ampia bibliografia

• mwaue(EN) mwauimwaumDiscovery of RNA Interference presentazione della RNAi (richiede mwauqFlash)

• mwauy(EN) Database degli siRNA, su rnainterference.org. URL consultato il 12 luglio 2006 (archiviato dall'url originale il 18 ottobre 2005).

• mwaug(EN) Latest research Ultime novità sulla RNA interference, su techbio.info. URL consultato il 12 luglio 2006 (archiviato dall'url originale il 19 agosto 2006).

• mwauo(EN) mwausmwauwNavigating journey of genome to medicine mwau0Archiviato il 29 giugno 2005 in Internet Archive., articolo sull'mwau8mwavaInternational Herald Tribune

• mwavi(EN) mwavmVideo di 15 minuti che spiega i principi alla base della RNAi, della rete pubblica statunitense mwavqPBS

• mwavy(EN) RNA interference Database, contenente dati fenotipici ottenuti dagli studi sulla RNAi in C. elegans